中药材及饮片DNA鉴定技术研究及应用

本文转自：中国医药报

□陈士林 汪波

中药材及饮片的准确鉴定是中药监管的重要问题和环节，是用药安全的关键。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）共收载中药材及饮片616种，其中多基原药材占近1/4。受物种延续性、变异性和复杂性等因素的影响，中药材品种混乱、基原复杂以及同名异物或同物异名等现象普遍存在，给中药监管带来很大挑战。全国市场质量抽检数据显示，2013—2020年，我国中药材及饮片总体合格率分别为64%、68%、75%、77%、84%、88%、91%、96%，表明系列监管措施和现代检验科学技术的运用促使中药材及饮片合格率呈稳步向好趋势，但混伪品冒充正品或掺伪等问题仍较为突出。2021年国家药监局组织开展的中药饮片专项抽检及中药材质量监测结果显示，混伪品代用、掺杂问题依旧存在，如藏柴胡冒充柴胡、关苍术及杂交苍术掺伪冒充苍术、苋菜子掺伪青葙子等提示对这些问题仍须高度关注。

准确可靠的鉴定方法对保障中药产业健康发展起着举足轻重的作用。传统中药鉴定方法往往依赖中药形态特征及化学特征，易受多种因素影响，难以从根本上解决鉴别准确性的问题。DNA条形码技术作为经典鉴定手段的延伸，是利用生物体DNA中一段保守片段，对物种进行快速准确鉴定的新兴技术，相比传统方法具有更好的通用性、重复性和可比性，是现代中药质量控制和监管中的重要组成部分。

中药材DNA条形码标准数据库构建

物种差异归根结底是基因型差异，DNA如“身份证”一样具有唯一性。DNA条形码技术利用标准基因片段对物种进行快速、准确识别与鉴定，具有通用性，能够用来区分不同物种。中药材DNA条形码技术的广泛应用需要存储海量数据的数据库作支撑。

在药用植物DNA条形码序列筛选中，研究团队从叶绿体基因组、线粒体基因组和细胞核基因组三个部分进行了筛选和对比，提出将核糖体DNA内转录间隔区（ITS）分为3段。其中，长度约为230bp的ITS2序列提取测序较容易，物种鉴定能力更强，更加适合用于对中药材等存在DNA降解材料的鉴定，且鉴定效率显著优于国际生物条形码协会植物工作组推荐的序列组合。研究团队在国际上首次提出将ITS2序列作为药用植物标准DNA条形码，同时建议将ITS2作为新的通用条形码用于鉴定更广泛的植物类群，实现了从跟随国际研究到引领国际研究的华丽转身。“ITS2作为药用植物通用DNA条形码研究”“中草药DNA条形码鉴定”等科研论文在一系列国际权威SCI杂志发表后，引发了国际社会对ITS2序列研究的关注。

经过10余年持续研究，研究团队建立了全球最大的中草药DNA条形码鉴定数据库和药用植物DNA条形码鉴定网站（htt p:// www.gpgenome.com/blast）。该数据库收载了2万余个物种，除了《中国药典》收载的药材及4.8余万份混伪品样品外，还涵盖美国草药典、日本药局方、欧洲药典、韩国药典和印度药典收载的绝大多数植物药。

中药材DNA条形码鉴定体系构建及应用

基于ITS2作为中药通用DNA条形码序列的研究，研究团队从中药材鉴定体系构成、标准操作流程建立、中草药物种鉴定数据库平台建设、鉴定软件系统开发等多方面，创建了包括以ITS2序列为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码，以及以COI序列为核心、I TS2为辅助序列的动物类药材DNA条形码的中药材DNA条形码鉴定体系，为中草药建立了“基因身份证”。实现了利用中草药“基因身份证”的标准化鉴定，开发了具有中国自主知识产权的中药高通量DNA条形码鉴定一体机。同时，该技术体系可实现对中国、美国、日本、欧洲、韩国和印度等国家和地区药典收载的草药进行DNA条形码物种鉴定。2017年3月，在由中国科学报社、人民网等单位共同主办的“2016中国十大医学进展/新闻人物”评选活动颁奖典礼上，该成果被评选为“2016 年中国十大医学进展”。此外，该成果还荣获2016年度国家科技进步奖二等奖；被世界中医药学会联合会（WFCMS）评价为“标志着中药进入标准化的基因鉴定时代”；2017年，《自然》杂志专刊评述该体系“开辟了中草药鉴定新篇章”。

“中药材DNA条形码分子鉴定法”作为指导原则已被纳入《中国药典》，鉴定体系也已被国内外众多检验机构、科研院所、高校、药材生产及流通企业、医院等应用。大量应用实践表明，该技术体系从基因层面有效解决了传统中草药千百年来物种真伪鉴定的难题，可广泛用于中药材源头加工、生产、流通、研究等各个环节，为中药材鉴定提供全方位保障，从而服务中药监管，助力产业品质提升。

基于DNA条形码标准序列的快速鉴定方法研究及应用

中药材的生产及流通处于产业链前端，是最需要中药鉴定技术的环节。将中药DNA条形码鉴定技术与核酸现场即时检测技术交叉融合，以适应中药材现场快速鉴定的不同场景，已成为必要。

研究团队通过将DNA条形码技术与等温DNA扩增技术、侧向流检测试纸（LFD）装置相结合，成功研发出一种快速鉴定剧毒植物钩吻的方法。该方法易于执行且不需要专业设备，可在30分钟内产生可靠结果，适用于钩吻的现场快速鉴定。

此外，研究团队创新性地利用多重连接依赖式探针扩增技术、核糖核酸酶H依赖性PCR结合熔解曲线，根据DNA条形码标准序列中稳定的变异位点，建立了针对苍术、菟丝子、石菖蒲、人参、党参、半夏、薄荷、麦冬等近30种中药材的掺杂鉴定方法，拓宽了DNA条形码分子鉴定技术的使用范围。目前已将其应用到国家评价性抽验非标方法研究及中药材补充检验方法建立研究中，为快速现场鉴定提供了新思路，推动形成涵盖现场快速检测的中药DNA条形码快速鉴定模式。

由于DNA条形码技术在物种鉴定方面效果显著，目前已广泛应用于植物快速准确鉴定。事实上，针对标准植物DNA条形码近缘物种分辨率有限的问题，早在2008年加拿大植物无国界（Botany without Borders）会议上，就有学者提出超级条形码（ultrabarcoding）的概念，认为叶绿体全基因组序列包含的信息量与动物线粒体COI基因序列相当，应该可以将叶绿体基因组的整个序列作为条形码使用。

近年来，测序技术不断进步。研究团队创造性地将“本草基因组学”这一概念和理论引入中药材鉴定领域，在针对疑难品种的条形码鉴定研究中，重点采用叶绿体全基因组序列开展物种鉴定。研究团队建立了中草药单分子实时DNA测序技术用于叶绿体基因组测序，利用该技术可以快速获得大量用于“超级条形码”（super-barcode）鉴定的叶绿体基因组序列。通过多序列比对，研究团队发现薯蓣属叶绿体基因组中基因间隔区以及非编码区变异率高于保守的蛋白编码区域，LSC区、SSC区变异率大于IR区，并筛选出了10个潜在的适合用于鉴定薯蓣属植物的特异性DNA条形码序列，其中包括5个蛋白编码基因和5个基因间隔区。系统进化树显示，叶绿体全基因组序列可作为薯蓣属物种鉴定的“超级条形码”，为薯蓣属系统进化以及物种鉴定等领域研究提供依据。

研究团队在考察大样本量不同常用DNA 条形码序列组合的鉴定能力时发现，常用分子标记对典型多基原药材大黄的鉴定效率均不足70%。叶绿体基因组作为植物鉴定的“超级条形码”，在物种鉴定中具有独特优势。研究团队利用高通量测序技术获得大黄药材基原物种掌叶大黄、药用大黄及唐古特大黄的叶绿体基因组，并基于“超级条形码”开发得到“特异条形码”，有效解决了大黄药材基原鉴定问题。同时，该成果在大黄配方颗粒标准研究制定过程中起到积极作用。另外，研究团队通过采用贝母属10个物种26个样本的叶绿体基因组序列，也验证了“超级条形码”对近缘物种准确鉴定的有效性。

值得关注的是，受限于应用成本以及数据分析所需服务器设施等因素，“超级条形码”目前尚不能如 DNA条形码一样广泛推广。因此，研究团队为解决DNA条形码目前难以鉴定近缘物种的困境，针对既定植物类群，在叶绿体基因组测序的基础上筛选得到“特异条形码”。该条形码结合了单位点条形码鉴定速度快、“超级条形码”变异位点多的优势，可有效应用于种及种下分类等级植物鉴定。

随着现代杂交育种技术的广泛应用，中药材杂交品种成为可能。种质是中药材品质安全、有效和质量可控的物质基础。不同物种之间杂交产生的杂交品种，虽然性状等鉴别特征与亲本差别微小，但由于化学成分很可能发生了改变，其是否能够作为中药材使用、临床功效是否受到影响等药品安全有效性问题尚无明确定论，给中药质量控制和监管带来很大的考验。

今年3月，国家药监局、农业农村部、国家林业和草原局、国家中医药管理局联合发布的《中药材生产质量管理规范》明确，禁用人工干预产生的多倍体或者单倍体品种、种间杂交品种和转基因品种。由于种间杂交品种同时具备母本和父本的遗传特征，短片段的DNA条形码及细胞器基因组的“超级条形码”无法满足针对这类复杂品种的鉴定需求。为保证中药材种质的纯正性，降低不确定种质带来的风险，建立有效的鉴定方法十分必要。随着高通量测序技术的发展，大量物种的基因组数据也在不断公布更新，但对于一些基因组偏大、杂合率较高、重复序列颇多、倍性较复杂的中药材物种来说，全基因组测序技术成本太高。简化基因组测序，即利用限制性内切酶打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序，从而获得海量遗传多态性标签序列，以充分代表目标物种全基因组信息的策略，为我们从全基因组层面解决杂交品种鉴定问题提供了新思路。

中华草龟（习称乌龟）是中药材龟甲、龟甲胶的唯一法定来源，市场需求量较大。由于乌龟性成熟期长、生长缓慢，水产养殖成效受到限制，市场上乌龟伪品、混淆品充斥。中华花龟（习称花龟）生长速度较快，但生态位窄，因此环境适应性较差，其大范围养殖同样受到限制。人工培育的父本乌龟与母本花龟的杂交品种——花杂草龟充斥市场，给中药饮片市场监管带来很大的挑战。由于花杂草龟同时保留了亲本龟的中间表型特征和基因型，使得传统性状鉴别方法以及常用分子鉴别方法均无法对其进行区分。研究团队利用高通量测序技术，构建了首个乌龟简化基因组测序文库以及花龟重测序基因组文库，获得高质量SNP标记 88087个，设计了用于杂交品种花杂草龟鉴定的通用引物，开发了“特异条形码”，并起草了补充检验方法，有效解决了针对杂交龟甲充斥市场的监管技术难题。

经过10余年的发展，DNA条形码技术在中药鉴定领域的研究和应用更加广泛和深入。从单序列及其组合，到细胞器基因组的“超级条形码”，再到基于全基因组遗传多样性信息开发的“特异条形码”，DNA条形码技术助力中药材现代鉴定技术研究和应用发展，并成为避免中药材市场陷入“劣币驱逐良币”恶性循环的有效手段。

此外，研究团队依据多个国家和地区药典收录的草药物种，完成全球药典草药基因组数据库建设并上线。该数据库依据中国药典、美国草药典、日本药局方、韩国药典、印度药典、埃及药典、欧洲药典以及巴西药典等，收录903个草药物种的34346条数据，包括867个物种的21872条DNA条形码数据，674个物种的2000余个细胞器基因组及核基因组数据等。该数据库是全球首个针对药典收载草药物种的大型基因组学数据库，将为草药物种鉴定、用药安全等提供信息支撑。今年1月，该数据库研究入选了中华中医药学会发布的“2021年度中医药十大学术进展”。

然而，目前DNA条形码技术在药检系统中的应用还有待深入推广，相关检验业务开展较少，相关标准制修订和执行仍有待推进。如何使现代中药鉴定技术广泛应用于中药检定工作，如同理化检验、色谱技术等在中药质量控制及监督检验中得到普及一般，是当下需要思考和摸索的问题。研究团队认为，可以从以下几个方面入手。一是加快适应中药日常检定工作的法定中药DNA条形码信息数据库完善及相关鉴定软件的开发。二是加强多学科、多技术方法的融合，推动中药材DNA条形码技术自动化研发进程。三是推动地方标准、行业标准等标准中针对具体物种的DNA条形码鉴定研究及相关标准制定工作的开展，推广中药材DNA条形码技术在中药监管中的应用。

中医药产业发展必须依靠科学和技术，只有推动原创性技术的研究应用才能更好地助力中药材产业发展。未来，中药材DNA条形码技术将会越来越多地参与到中药材质量控制研究中，更好适应时代发展的需要，推动中药材质量控制水平迈上新台阶。